近年来，随着生物医药技术的飞速发展，纳米材料在疾病诊断、靶向治疗及药物递送系统中的应用日益广泛。无论是天然来源的外泌体，还是人工合成的纳米颗粒，其粒径大小与颗粒浓度均直接影响其临床应用效果。因此，对纳米颗粒进行精确的尺寸与浓度表征显得尤为关键。

纳米颗粒追踪分析技术（NTA）因其能够实时、直观地观测纳米颗粒的布朗运动，并据此计算粒径分布与浓度，已成为该领域常用的检测手段之一。该方法具有快速、无需复杂前处理等优点，适用于多种类型的纳米材料（如外泌体）分析。

然而，目前NTA技术尚无统一的标准操作规程，导致不同实验室间的数据可比性受限。实际检测过程中，诸多因素如样品的初始浓度、相机的捕捉参数（如曝光时间）、视频采集次数与时间、样品注入方式及流速等，均可能显著影响最终的测量结果。此外，样品本身的分散状态，如是否发生团聚或沉淀，也会对粒径和浓度的测定带来偏差。

因此，为提升NTA检测数据的准确性与可重复性，有必要对上述各项实验参数进行系统优化与标准化评估，从而建立科学、可靠的NTA表征方法体系，为外泌体等纳米医学的研发与质量控制提供有力支撑。

2024年4月5日，中国科学院上海药物研究所在国际知名药剂学期刊International Journal of Pharmaceutics上发表名为Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis的研究文章。该文章系统地探讨了多种实验因素对纳米颗粒追踪分析（NTA，使用NanoSight NS300系统）技术测量结果的影响，包括样品组成、浓度水平、仪器参数设置、相机采样条件以及样品注入流速等关键变量。为全面评估NTA技术的准确性与可靠性，研究团队还引入了多种正交验证手段，该研究不仅揭示了NTA检测中易被忽视的操作偏差来源，也为建立标准化、可重复的纳米颗粒检测程序提供了重要的实验依据和技术指导。

研究团队选用不同粒径的聚苯乙烯（PS）和二氧化硅（SiO₂）标准纳米颗粒，在多种浓度条件下进行NTA检测，系统评估了颗粒浓度对测量结果的影响。通过对比不同浓度下的平均粒径与浓度偏差，研究发现：当颗粒浓度处于10⁸–10⁹ particles/mL区间时，NTA测量结果最为稳定，数据线性关系良好，重复性高。在此浓度范围内，视野中可追踪的颗粒数量维持在10–100个，为后续实验提供了理想的参考区间。

与动态光散射（DLS）技术不同，NTA依赖于高灵敏度相机实时捕捉纳米颗粒的布朗运动轨迹，因此相机设置对测量精度具有关键影响。研究人员采用多尺寸混合的PS标准颗粒，在不同曝光等级（camera level）下进行测试，系统评估曝光度对成像质量及数据分析的影响。

结果显示，当曝光度设置在6–9区间时，100 nm颗粒信号较弱、难以有效识别，而200 nm颗粒则成像清晰；当曝光度提升至10–14时，100 nm颗粒可被稳定追踪，但200 nm颗粒出现过曝现象，导致轨迹识别失真。进一步对100 nm、120 nm、150 nm、170 nm和200 nm的PS颗粒进行粒径分布分析发现，尽管曝光度变化未显著改变各组颗粒的主峰位置，但随着曝光值升高，整体平均粒径呈现上升趋势。

曝光度对NTA测量结果的影响

研究指出，颗粒尺寸与曝光参数之间存在协同效应，尤其在多分散样本中，难以通过单一曝光设置兼顾所有粒径组分的清晰成像。因此，研究者建议在实验报告中应明确记录NTA的相机参数设置，以提升数据的可追溯性与透明度。

已有研究表明，溶液粘度会影响NTA的测量准确性，但流体泵速的影响尚不明确。为此，研究团队在不同泵速条件下对多种尺寸的PS颗粒进行测试。测试结果表明，对于粒径小于200 nm的纳米颗粒，当泵速控制在50 AU以内时，可获得较为准确的粒径与浓度数据；而对于更大尺寸的颗粒，则需进一步降低流速，以减少流动干扰，确保布朗运动的有效捕捉。该发现表明，在实际检测中，应根据样本特征优化流速参数，避免因流体动力干扰导致数据发生偏差。

泵流速对NTA测量结果的影响

最后，研究团队选取两种典型生物来源的外泌体——分别来源于HEK293细胞和干姜提取物，采用NTA、DLS、透射电镜（TEM）和RPS四种技术进行平行分析。

在粒径检测方面，NTA结果与TEM的观测数据高度一致，显示出良好的准确性；DLS测得的粒径普遍偏大，可能源于其对大颗粒信号的加权偏好；而RPS结果相对偏小，这与其直接测量颗粒物理直径的原理相关。

NTA、DLS、TEM和RPS对两种生物样本的粒径测量结果

这个研究系统地揭示了NTA技术在纳米颗粒表征中的关键影响因素，为建立标准化操作流程提供了重要依据。同时，通过与多种正交技术的对比，凸显了不同方法的适用边界与互补价值。对于外泌体等复杂生物纳米颗粒的研究，建议结合多种表征手段，实现更全面、准确的分析。

在此，科诺实验室提醒您：在进行外泌体或合成纳米颗粒的粒径与浓度检测时，选择合适的技术平台并严格控制实验参数，是确保数据可靠性的关键。我们配备Malvern Panalytical最新款NTA设备——NanoSight Pro系统，可为您提供标准化、高重复性的NTA检测服务，并结合专业建议，助力您的科研与转化研究。

NanoSight Pro系统